Vật liệu và Phương pháp

Thu thập mẫu. Tổng cộng có 96 mẫu mô cơ cá đã được thẩm định đã được thập, đại diện cho 88 loài khác nhau. Các mẫu mô cá được cung cấp bởi FDA - Trung tâm An toàn Thực phẩm và Dinh dưỡng Ứng dụng (Tài liệu bổ sung-Bảng S1). Những mẫu này được lấy từ Thư viện Trình tự Tiêu chuẩn Tham chiếu của FDA về Nhận dạng Hải sản (http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/DNASeafoodIdentification/ucm238880.htm) và tất cả đều được liên kết với các mẫu đã được chứng thực. Các mẫu này được sử dụng để xây dựng một thư viện mã vạch DNA, như mô tả dưới đây. Ngoài ra chúng được sử dụng để tối ưu hóa các mồi mã vạch mini được bố trí trong nghiên cứu này. Để phân tích mồi mã vạch mini với các sản phẩm thương mại, tổng cộng 44 sản phẩm thủy sản chế biến nặng

đại diện cho nhiều loài và chủng loại sản phẩm đã được mua tại Hoa Kỳ vào tháng 5 năm 2012 từ các nguồn bán lẻ trực tuyến (Hình 1). Các mẫu nhỏ đã được thu thập từ mỗi sản phẩm sử dụng kẹp và dao cắt vô trùng và được bảo quản trong các ống 1,5 ml ở -70 ° C. Các mẫu nhỏ được chuyển tới Viện Đa dạng sinh học Ontario tại Đại học Guelph để chiết xuất và lập trình tự DNA.

Chiết xuất DNA. Đối với mỗi mẫu chứng thực hoặc mẫu thương mại, một gram mô/sản phẩm được phân chia vào các ống ma trận lysing 10 MP “A” (100 mg mỗi ống) và được đồng nhất bằng thiết bị MP FastPrep-24 (MP Biomedicals Inc.) ở tốc độ 6 trong 40 giây. Tổng số DNA của hỗn hợp đồng nhất này được chiết xuất bằng cách sử dụng bộ mô tế bào Nucleospin (Macherey-Nagel Inc.) theo các hướng dẫn của nhà sản xuất và lọc trong 50 μl nước sinh học phân tử.

Hệ thống đánh dấu mã vạch DNA mini để xác thực các sản phẩm các đã qua chế biến.

Xây dựng thư viện DNA mã vạch. Khu vực mã vạch tiêu chuẩn COI (652 bp) đã được khuếch đại cho mỗi trong số 96 mẫu chứng thực bằng cách sử dụng một cặp mồi cá thoái hoá mới được bố trí (Bảng 1) cũng như một loại cocktail mồi đã được mô tả trước đây27. Mỗi phản ứng khuếch đại chứa 2 μl mẫu ADN, 17,50 μl nước sinh học phân tử, 2,5 μl chất đệm phản ứng 10X, 1 μl MgCl2 (50 μM), 0.5 μl hỗn hợp dNTPs (10 mM), 0.5 μl mồi (10 μM), 0.5 μl mồi đảo ngược (10 μM), và 0.5 μl Invitrogen’s Platinum Taq polymerase (5 U/μl) trong tổng thể thể tích 25 μl. Các điều kiện PCR đã được khởi động với nắp đậy được đun nóng ở 95°C trong 5 phút, tiếp theo là tổng cộng 35 chu kỳ của 94°C trong 40 giây, 51°C trong 1 phút, và 72°C trong 30 giây và kết thúc kéo dài ở 72°C trong 5 phút, và giữ ở 4°C. Phản ứng PCR đã được thực hiện bằng cách sử dụng các máy gia tốc nhiệt của Mastercycler ep gradient S (Eppendorf, Mississauga, ON, Canada). PCR thành công đã được xác minh bằng 1,5% agarose gel điện di. Một phản ứng kiểm soát  cực âm mẫu DNA đã được bao gồm trong tất cả các thí nghiệm để kiểm tra lây nhiễm. Hai microliters của mỗi amplicon sau đó được sử dụng trực tiếp cho trình tự sắp xếp Sanger hai chiều với mồi M13 được mô tả trong Bảng 1 bằng cách sử dụng Hoá chất Applied Biosystems BigDye Terminator V3.1 (Foster City, CA, USA). Các phản ứng tuần tự đã được làm sạch bằng cách sử dụng EdgeBio’s AutoDTR96 (Gaithersburg, MD, USA) và được hiển thị trên sequencer ABI 3730xl (Applied Biosystems) 28,29. Việc hiệu chỉnh chuỗi và lắp ráp contig đã được thực hiện bằng cách sử dụng CodonCode Aligner v 3.7.1.1 (CodonCode Corp., Dedham, MA, USA). Việc xác định các mẫu kiểm định đã được tiến hành bằng cách sử dụng BLAST trong GenBank và một thư viện mã vạch địa phương cho các taxa được lựa chọn với mức cắt giảm BLAST tối thiểu trong 98% cho một cặp đứng đầu. Các số liền kề của các chuỗi được tạo ra có sẵn trong Tài liệu bổ sung-Bảng S1.

Shadi Shokralla , Rosalee S. Hellberg, Sara M. Handy, Ian King và Mehdrad Hajibabaei