Bộ mồi COI vừa được thiết kế đã được sử dụng để khuếch đại mã vạch DNA đủ dài trong 96 mẫu đã được chứng thực từ FDA. Để so sánh, một cocktail mồi được thiết kế trước đó cũng được sử dụng để khuếch đại các mẫu này27. Các chuỗi COI được tạo ra từ các mẫu chứng thực, cùng với các chuỗi COI duy nhất được tải xuống từ GenBank và BOLD, sau đó được sử dụng để thiết kế các bộ mồi mã vạch mini để khuếch đại các đoạn cục bộ trong vùng mã vạch chuẩn COI

(Hình 2). Các mồi đã được lựa chọn dựa trên sự có sẵn của các vị trí bắt mồi được giữ gìn chặt chẽ trong nhiều loài với sự xem xét độ ổn định mồi trong phản ứng PCR cũng như các đặc tính vật lý và cấu trúc của oligos (nhiệt độ ủ, tỷ lệ phần trăm G + C, sự hình thành kẹp tóc, và sự hình thành self và hetero-dimer). Phân tích in silico cũng được thực hiện bằng cách sử dụng UCLUST30 và MEGA V5.2.231 trên các mồi mã vạch mini mới được thiết kế để đánh giá tiềm năng đối với các mục tiêu khuếch đại để phân biệt các loài cá ở mức 98% và 100% (Bảng 2 và Bảng S2). Phân tích bao gồm mã vạch DNA đủ dài đại diện cho 200 loài và 124 chi thu thập từ Thư viện trình tự tiêu chuẩn tham chiếu của FDA về Nhận dạng Hải sản. Các đuôi chuyển tiếp và đuôi đảo ngược được gắn liền với mồi mã vạch chuyển tiếp và đảo ngược, để tạo ra trình tự thông lượng cao. Công cụ phân tích Công nghệ DNA Tích hợp (IDT) được sử dụng để đánh giá tất cả các tham số đã đề cập32. Sáu bộ mồi mã vạch mini đã được chọn (Bảng 1) để thử nghiệm thêm với các mẫu thương mại.

Shadi Shokralla , Rosalee S. Hellberg, Sara M. Handy, Ian King và Mehdrad Hajibabaei